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　　“elisa試劑盒"常見的問題及解答

　　問：抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事?

　　答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。

　　問：蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么?

　　答：可能是：a)樣品濃度過低;b)轉(zhuǎn)移時間不夠。

　　問：磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等?

　　答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。

　　問：要驗證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎?做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎?

　　答：①免疫組化可以用來進行定位，但是不能定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分;Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定量，但是不能定位。

　　②兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

　　問：做Western Blot時，提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑)，用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

　　答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融;2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程，提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

　　問：細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot?

　　答：一般5×10^6就足夠了

　　問：同一樣品能同時提RNA又提蛋白么?這樣對western blot有無影響?

　　答：能，沒有問題。

　　問：同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?

　　答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

　　問：如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么?

　　答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

　　問：我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決?

　　答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間，加20%甲醇。

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